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Obtención y caracterización de mutantes telomerasa negativas de Ustilago maydis.
E. Anastacio Marcelino, P. Sánchez-Alonso.
Centro de Investigaciones Microbiológicas, Instituto de Ciencias de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Complejo de Ciencias, edificio 76 3er. piso. C.U. 72570 Puebla, Pue. México. mpgalon@siu.buap.mx
RESUMEN.

La telomerasa es una transcriptasa reversa especializada que sintetiza el extremo cromosomal de los eucariotes. Sus componentes centrales son una subunidad catalítica protéica y un molde de RNA. La telomerasa es escencial en microorganismos eucariotes y se desconoce si está regulada durante la transición dimórfica de éstos. En este trabajo reportamos la obtención de mutantes telomerasa negativas en el hongo dimórfico Ustilago maydis. Las mutantes sobreviven 120 generaciones en promedio antes de entrar en crisis, después de la cual aparecen sobrevivientes. La longitud de los telómeros en las mutantes utert de Ustilago maydis se midió cada 12 generaciones y se reporta.



INTRODUCCION

La telomerasa es la enzima que sintetiza los repetidos del telómero en prácticamente todos los eucariotes. Los componentes centrales de esta enzima son una subunidad catalítica protéica con características de transcriptasa reversa7, y un molde de RNA que se encuentra unido no covalentemente a la subunidad catalítica9. Los factores limitantes para actividad de la telomerasa son precisamente la subunidad catalítica (hTERT) y el molde de RNA18, aunque la expresión y la actividad de la telomerasa se encuentran estrictamente reguladas tanto en metazoarios, como en eucariotes unicelulares5, 10, y la capacidad de las células para replicarse se ha asociado con el funcionamiento de ésta enzima y el alargamiento de los telómeros.

En humano se ha reportado que la mayoría de las células somáticas muestran cantidades prácticamente indetectables de telomerasa, mientras la mayor parte de las células tumorales cancerosas, células germinales, y las células tallo exhiben actividad de telomerasa20, 21. La carencia de ésta enzima en metazoarios provoca condiciones genéticas prácticamente irreversibles durante el desarrollo. La carencia de actividad de telomerasa en células tallo mesenquimales de ratón impiden su diferenciación celular16; y en humano la mutación en el componente de RNA de la telomerasa provoca una condición genética conocida como diskeratosis congénita, que le provoca a quien la padece una falla en la función de células tallo y un fenotipo de envejecimiento prematuro. Existen sin embargo, otros factores independientes de la telomerasa también contribuyen a la extensión de vida de un organismo y ésto se ha demostrado utilizando las células tallo hematopoyéticas de ratón1.

Debido a que el molde de RNA, así como varias de las proteínas esenciales del complejo pueden expresarse constitutivamente en algunos tejidos, y debido a que la expresión de la subunidad transcriptasa reversa es el único factor necesario el restablecimiento de la actividad telomerasa3, el estudio del control de la regulación de subunidad catalítica se tomado como modelo para hacer inferencias sobre la regulación del complejo en general, y actualmente se conoce que algunas proteínas relacionadas con el desarrollo de tumores malignos juegan papeles importantes en la regulación de la subunidad catalítica de la telomerasa de humano (hTERT)6.

Los hongos dimórficos han sido excelentes modelos para el estudio del desarrollo y diferenciación celular, así como de la regulación de ésta. Organismos modelo como Aspergillus nidulans, Podospora anserina, Neurospora crassa, y Ustilago maydis, han permitido conocer la regulación molecular de procesos celulares como la conidiación asexual, la senecencia19, la diferenciación celular regulada por la luz15, así como la regulación del dimorfismo y desarrollo de la patogenésis2. Recientemente se ha descrito el descubrimiento en Ustilago maydis de genes rum1, un homólogo de RBP217, que es una proteína de unión a retinoblastoma en humano, y de BRCA213, 14 , que originalmente se pensó que eran exclusivos de mamíferos, y más recientemente cru1, un activador APC que se requiere para la infección en Ustilago maydis4. Estos antecedentes muestran en pespectiva a un organismo modelo que puede ser útil como alternativa para el estudio de los mecanismos de regulación de genes expresados diferencialmente durante el desarrollo morfogenético, que puede rendir datos extrapolables a mamíferos o plantas. En este trabajo la obtención y caracterización del gen que codifica para la telomerasa de Ustilago maydis, como un primer paso para la búsqueda de posibles genes y mecanismos involucrados en el control de la expresión de la telomerasa de Ustilago maydis.
RESULTADOS Y DISCUSION.

En U. maydis el extremo cromosomal está constituido por repetidos de la secuencia TTAGGG, arreglados en tandem formando tramos largos de 37 a 39 repetidos teloméricos en promedio11.

Previamente se demostró en nuestro laboratotio, que el alargamiento de los telómeros de Ustilago maydis se lleva a cabo por la vía de la telomerasa. La actividad de telomerasa puede detectarse en cultivos no sincronizados del hongo creciendo en su forma haploide levaduriforme, y aún durante la senescencia cronológica de las esporidias, donde no muestra disminución de su actividad (Bautista-España, Manuscrito en preparación). Los ensayos de TRAP muestran que actividad de telomerasa que se encuentra presente también en las células de la fase micelial, este resultado coincide con el hallazgo en los tumores del maíz, de transcritos de lo que hemos llamado UTERT, un marco de lectura aberto de 4113 pb (secuencia gentilmente enviada por el Dr. Peter Schreier, Bayer Crop. Sci., antes de la liberación de las secuencias del genoma de Ustilago maydis), la cual que codifica para una proteína putativa que exhibe todos los motivos conservados de la subunidad catalítica de las telomerasas (Bautista-España, Manuscrito en preparación).

En éste trabajo UTERT fué interrumpida con un cassette que porta en gene de resistencia a hygromycina y aproximadamente 1000 pb de secuencias de los extremos 5’ y 3’ de UTERT. Este cassette fué diseñado por el Dr. W. K. Holloman (Medical Weill College, Cornell University, comunicación personal), así como los oligonucleótidos para la detección de mutantes.. La estrategia para la interrupción del gene UTERT de muestra como diagrama en la figura 1A. La interrupción con el cassette de resistencia a hygromycina impide la amplificación de un fragmento de 894 pb gene original (diagrama de arriba) mientras que la introducción de un iniciador reverso diseñado a partir de las secuencias del gene hygromycina fosfotransferasa permite la amplificación de un fragmento de aprox 1290 pb que permiti distinguir la presencia del gene interrumpido (diagrama de abajo). La resolución de fragmentos obtenidos para diferentes cepas se muestra en la figura 2B y el fenotipo de las colonias transformantes se muestra en la figura 2C. La mutante utert521-4 fue utilizada en este trabajo (fig. 2B). Después de la transformación, la cual se llevó a cabo como describen Fotheringham and Holloman (1989) las transformantes fueron cultivadas en medio de papa y dextrosa (PDA Difco) y se tomaron alicuotas cada 36 generaciones a partir de la generación 76 y del control después 48 generaciones. En la figura 2 se muestra el patron de señales del telómero de las alícuotas muestreadas después de más de 250 generaciones. Debido a que el promedio de la longitud del telómero es de 240 pb aproximadamente, en la mayor parte de las bandas un acortamiento de menos de 1kb precede a un desvanecimiento de la senal de hibridación, lo cual es congruente con la longitud reportada previamennte. Bajo condiciones similares, un cultivo de U. maydis WT fue sometido al análisi para determinar la longirud del telómero a intervalos de 18 generaciones hasta 300. La longitud del repetido telomérico se mantuvo estable Figura no mostrada. De igual manera las cepas FB1 e I2A no mostraron acortamiento del telómero durante la senescencia cronológica.(datos no mostrados).




La cepa mutante utert521-4 después de 284 generaciones mostró un crecimiento lento pero unifrome que corresponde a la selección de supervivientes telomerasa-negativas en las cuales se ha reactivado la vía de mantenimiento de telómeros ALT (dato no mostrado). Actualmente se está caracterizando esta cepa de supervivientes para determinar los cambios que aparecen en la región subtelomérica. Los datos anteriores indican que la telomerasa de Ustilago maydis está codificado por el gen que aquí denominamos UTERT, y que al igual que en accharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe después de la pérdida de telómero, Ustilago maydis es capaz de sobrevivir utilizando una vía alternativa para el mantenimiento de sus extremos cromosomales, queda por determinar la participación de el marco de lectura abienta albergado en la región subtelomérica de sus cromosomas en la vía alternativa de mantenimiento del extremo cromosomal.

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