Centro de ingeniería genética y biotecnologíA "Efecto regenerador del Factor de Crecimiento Epidérmico en la neuropatía periférica" Trabajo presentado como propuesta a


Efecto de EGF en la neuropatía inducida por acrilamida en ratas



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Efecto de EGF en la neuropatía inducida por acrilamida en ratas

Se usaron ratas machos de 250 a 300 g de peso corporal. Los tratamientos se realizaron 5 días a la semana durante 8 semanas. Los animales se dividieron en 3 grupos de 13 animales cada uno, correspondientes a diferentes tratamientos: 1) control saludable, tratado con tampón fosfato como vehículo (PBS); 2) ACR+vehículo, tratado con ACR y PBS, y 3) ACR+EGF, tratado con ACR y 3 mg/kg de EGF. Se administró una dosis diaria de 20 mg/kg de ACR en la mañana, y la dosis de EGF y el volumen de PBS se dividieron en dos inyecciones por día.


Electrofisiología: Se introdujeron ratas anestesiadas (80 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de diazepam) dentro de una cámara de Faraday conectada a una tierra física para reducir las posibles interferencias eléctricas durante los registros y se colocaron sobre una manta térmica (36 ° C). Las ondas F se obtuvieron de los músculos de la pata durante la estimulación eléctrica en el tobillo (Horn et al., 2012). Para este propósito los electrodos de estimulación se introdujeron debajo de la piel, a ambos lados del extremo distal de la tibia, y los electrodos de registro se colocaron en el punto medio del dorso del pie (electrodo activo), y en la piel interdigital. Se aplicó un pulso cuadrado de 15 mA de intensidad, 0.1 ms de duración y 0.1 Hz de frecuencia. Los potenciales sensoriales (PS) se obtuvieron mediante el uso de electrodos colocados a una distancia de 3 cm (RE) y a 13 cm (SE) distalmente desde la base de la cola. Los parámetros de estimulación fueron 10 mA, 0,1 ms de duración y 0,1 Hz de frecuencia. Las evaluaciones electrofisiológicas se realizaron con intervalos de 20 días. El análisis estadístico se basó en comparaciones de los índices integrados de ondas F (iiO-F) y PS (iiPS), obtenidos a partir de la fórmula a/l×d, donde a es la amplitud (mV); l es la latencia de inicio (ms) y d es la duración (ms) (García del Barco et al., 2011)

Histología: Se obtuvieron muestras del nervio tibial distal de 5 mm de longitud del control sano y de ACR+vehículo y se procesaron para visualizar en microscopía óptica en forma de secciones transversales (1 a 3 μm) en portaobjetos. Se tiñeron con azul de Stevenel (del Cerro et al., 1980; Barret et al., 2008; Ulkay et al., 2013).

Reflejo de erección del pene inducido por apomorfina (AIPE):

Todos los animales de los diversos grupos se inyectaron con apomorfina 60 μg/kg por vía intraperitoneal 5 días antes de la última evaluación electrofisiológica. Seguidamente un observador no relacionado directamente con los códigos de identificación de cada animal y /o grupo, registró el número de episodios de erección del pene durante 30 minutos posteriores a la inyección de apomorfina (Sachs et al., 1994; Andersson, 2011). Los resultados se analizaron mediante un análisis de regresión (tiempo vs número de episodios de erección acumulados).



RESULTADOS

Neuropatía inducida por estreptozotocina en ratas

En el grupo de animales diabéticos tratados con vehículo se evidenció un incremento significativo en el tiempo de reacción frente al estímulo nociceptivo, en comparación con los controles, mientras que los tratados con EGF tuvieron un tiempo de reacción similar a los controles (Fig. 5)



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Fig. 5. Prueba de analgesia por inmersión de la cola en agua a 55oC. El tiempo de respuesta de retirada de la cola se encuentra estadísticamente incrementado (p˂0.05) en las ratas diabéticas que no recibieron EGF, según la prueba U de Mann-Whitney.

En el registro del potencial sensorial la velocidad de conducción se observó estadísticamente disminuida en las ratas diabéticas tratadas con vehículo, mientras que en el grupo tratado con EGF no se diferenció estadísticamente de grupo control sano.

Fig. 6. Velocidad de conducción nerviosa en los potenciales sensoriales tomados en la cola. El asterisco indica diferencia estadísticamente significativa (p˂0.05) según la prueba U de Mann-whitney, de dos colas.



Neuropatía inducida por acrilamida en ratones

El tratamiento con ACR produjo síntomas claros de neuropatía, con un aumento significativo en la escala de daño neurológico en comparación con el control saludable. Los dos grupos de EGF difirieron significativamente cuando se compararon con el grupo de ACR+vehículo y con el control saludable, aunque no difirieron estadísticamente entre sí (Fig. 7).



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Fig. 7. Valoración neurológica según Tabla 1. Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas según la prueba U de Mann-Whitney de dos colas.

Al final del tratamiento con ACR la fuerza muscular se redujo significativamente, pero se vio menos afectada, estadísticamente, en los grupos que recibieron EGF, aunque todavía exhibieron una reducción significativa en el tiempo de suspensión en comparación con el control saludable (Fig. 8).

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Fig. 8. Fuerza de agarre en la prueba de suspensión en la rejilla. Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p˂0.05), según las pruebas de Kruskal Wallis y de Dunn.

La proporción de animales considerados como enfermos en los grupos tratados con EGF no fue estadísticamente diferente en comparación con el control saludable, pero ACR+EGF-5 fue estadísticamente diferente de ACR+vehículo (Fig. 9).

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Fig. 9. Proporción de animales considerados enfermos al final de los tratamientos, según el criterio de la desviación estándar de los valores de amplitud del potencial M (en Materiales y Métodos). Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, según la prueba de la Probabilidad Exacta de Fisher.

En el grupo ACR+vehículo se produce un descenso progresivo en la amplitud M a lo largo del tratamiento. El análisis de regresión lineal de la reducción acumulada de la amplitud de M muestra que ACR+vehículo y ACR+EGF-1 no difieren significativamente entre sí, pero ambos difieren significativamente del grupo control sano y del grupo ACR+EGF-5, cuyas líneas de regresión se superponen (Fig.10).

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Fig. 10. Reducción acumulada de la amplitud del potencial de acción muscular compuesto (potencial M). Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas en las pendientes, según la prueba de regresión lineal.



Neuropatía inducida por acrilamida en ratas

Las ondas F y el potencial sensorial (PS) aparecen regularmente en las ratas del control saludable, pero ACR produjo una reducción marcada y significativa de sus índices (iiOF y iiPS). El examen histológico muestra daño severo en los axones del nervio tibial en ratas tratadas con ACR, con vainas de mielina alteradas e invaginaciones del axolema (Fig. 11).



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Fig. 11. (A). Valores de los índices integrales de la Onda F y del Potencial Sensorial de animales controles sanos y en intoxicados con acrilamida. (B) Imágenes representativas de microscopía óptica de los axones del nervio tibial de las ratas controles y de las ratas tratadas con acrilamida, bajo tinción con azul de Stevenel.


Ambos índices fueron estadísticamente menos afectados en el grupo tratado con EGF en comparación con ACR+vehículo, pero en el caso del iiOF, el grupo tratado con EGF todavía difirió significativamente cuando se compara con el control saludable (Fig. 12A). En los registros electrofisiológicos puede apreciarse que todos los componentes de los índices (a, l y ld) se ven afectados por la ACR, pero son menos afectados en el grupo tratado con EGF (Fig. 12B).



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Fig. 12. Índices integrales de las Ondas F y del Potencial sensorial (en A y C, respectivamente). Las letras desiguales indican diferencias estadísticamente significativas (p˂0.05), según la prueba de Kruskal Wallis seguida de la prueba de Dunn. Ondas F de ratas y Potenciales sensoriales (B y D) representativos de cada grupo.

Episodios de erección del pene inducidos por apomorfina. Los episodios de erección se muestran reducidos estadísticamente en los animales del grupo ACR+vehículo, no así en grupo de ACR+EGF, cuando se compararon con el grupo control sano (Fig. 13).

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Fig. 13. Episodios de erección inducidos por apomorfina. Las letras desiguales indican diferencias estadísticamente significativas (p˂0.05) según prueba de regresión lineal de los episodios acumulados en 30 min.



DISCUSIÓN

En los ratones con diabetes inducida por STZ la neuropatía periférica se expresó en una respuesta más lenta ante el estímulo doloroso ocasionado por la introducción de la cola en el agua a 55°C y por un aumento en la latencia de inicio del potencial sensorial, lo que es coincidente con lo informado por otros autores (Dyck et al. 2013). Estos parámetros fueron significativamente menos afectados en los animales que recibieron EGF.

Los animales intoxicados con ACR mostraron signos clínicos evidentes de deterioro motor, como se informado en publicaciones anteriores (Edwards 1975; LoPachin y otros, 2000; LoPachin y otros, 2002a; Lopachin et al., 2002b). Los pequeños saltos (saltillos) durante el inicio de la marcha aparecen como el primer signo clínico de debilidad de las extremidades traseras en los ratones, lo que probablemente refleja la incapacidad para comenzar la marcha con una sola extremidad. A medida que la intoxicación progresa este tipo de salto al inicio de la marcha desaparece, pero aparecen otros signos mucho más severos, como el arrastre de la pelvis y de las patas traseras. Adicionalmente, la disfunción de los nervios motores se expresa en una reducción significativa de la amplitud de M, coincidente con otros informes (Acevedo 2000; Watanabe 1994).

En este modelo de neuropatía periférica se usaron dosis relativamente altas de EGF, como una forma de contrarrestar los efectos neurotóxicos de las altas dosis de acrilamida usadas para la inducción de neuropatía.

La administración concomitante de EGF dio como resultado la atenuación de la neurotoxicidad de la acrilamida en ambas especies. Los ratones tratados con EGF exhiben un mejor grado neurológico en comparación con el grupo ACR+vehículo, así como también una mejora en los patrones electrofisiológicos. Cuando se comparó la proporción de ratones enfermos en cada grupo con los controles sanos al final de los tratamientos, se demostró un mejor efecto de protección en el caso del grupo ACR+EGF-5. De manera similar, las diferencias estadísticas entre las dos dosis de EGF se evidenciaron, además, mediante el análisis de regresión de la reducción acumulada de la amplitud M, donde solo se muestra eficaz la dosis de 5 mg/kg.

Con estas evidencias, el efecto de protección del EGF cumple el principio farmacológico básico de la relación dosis-efecto (Colquhoun 2006), que permite atribuir este efecto a una acción farmacológica real de esta proteína y no a un sesgo en el diseño experimental.

Las manifestaciones periféricas de la neurotoxicidad inducida por ACR involucran componentes motores y sensoriales, así como estructuras centrales en el cerebro (Edward, 1975; LoPachin et al., 2000; LoPachin et al., 2002a; LoPachin et al., 2002b). Por tanto, en este trabajo, otros parámetros y síntomas no exclusivos de las funciones motoras periféricas se tuvieron en cuenta al evaluar la neuropatía inducida por acrilamida. Tomando de conjunto los efectos sobre la onda F y el potencial sensorial, en este modelo se involucra tanto las estructuras centrales de la médula espinal como las fibras sensitivas y motoras de los nervios periféricos. En particular, las ondas F se consideran un parámetro electrofisiológico útil en la investigación de diferentes enfermedades neuropáticas, siendo especialmente relevantes en trastornos que involucran componentes centrales y periféricos, como diabetes mellitus y algunas radiculopatías (Andersen et al., 1997; Fisher, 2007; Forbes and Cooper, 2013; Fisher, 2014; Pan, 2014.

El efecto deletéreo de ACR en el iiOF y iiPS puede explicarse sobre la base de cambios importantes observados en los segmentos distales del nervio tibial, donde la estructura de las vainas de mielina se ve notablemente alterada. Aunque abordar los efectos del EGF por estudios histológicos no se encuentra entre los objetivos de este estudio, debe señalarse que la electrofisiología tiene la ventaja de ser un método no invasivo que permite seguir la evolución y la progresión del daño nervioso de una manera funcional, no necesariamente coincidente con los estudios histopatológicos (Arezzo et al., 2011).

El hecho de que el tratamiento concurrente con EGF pueda atenuar el deterioro causado por ACR en el iiOF y el iiPS sugiere que esta molécula es capaz de promover la neurorregeneración en paralelo y a la vez, en oposición a la acción perjudicial de la ACR, cuyo mecanismo neurotóxico aún se desconoce. Como para iiPS no hay diferencia estadística entre ACR+EGF y el control saludable, este parámetro parece estar mejor protegido que la iiOF, lo que concuerda con las evidencias que indican que las ondas F son un parámetro particularmente sensible en trastornos complejos como la neuropatía diabética, donde se encuentra afectado incluso en ausencia de síntomas clínicos (Andersen et al., 1997; Fisher, 2007). Una explicación a esto es la mayor complejidad funcional y estructural subyacente al desarrollo y a la aparición de ondas F, que implican conducción antidrómica en fibras motoras y conducción ortodrómica en fibras sensoriales, con estimulación sináptica posterior de los cuerpos celulares centrales de las neuronas motoras en la médula espinal (Fischer, 2007; Fischer, 2014).

Los resultados del estudio del reflejo de erección inducido por apomorfina, en este contexto tienen gran importancia porque evidencian el componente de disfunción autonómica, dado por la integridad y el funcionamiento de los nervios del plexo pélvico. Las ratas intoxicadas con ACR mostraron una reducción importante de los episodios de erección inducidos por apomorfina, lo cual sugiere una afectación importante no solo en las zonas del hipotálamo donde se encuentran los receptores D2 específicos para la apomorfina, sino también una alteración de los plexos nerviosos periféricos que tienen que ver con la integración del reflejo de erección del pene. Sin embargo, en el grupo que se trató con EGF la reducción del reflejo de erección se atenuó y esto implica cierta protección de la inervación periférica responsable de integrar y permitir el reflejo de erección

Recientemente se ha informado que altas dosis de ACR afectan diferentes áreas del sistema nervioso central, particularmente el hipotálamo, el cual se reconoce como el sitio de acción primario de la apomorfina como inductor de la erección del pene, una acción mediada a través de receptores de dopamina D2 (Yanagihashi et al. ., 1991; LoPachin y otros, 2002a; LoPachin y otros, 2002b; LoPachin et al., 2003). Estos resultados sugieren que el tratamiento con EGF podría ser útil para el abordaje de la disfunción eréctil presente en otros trastornos neuropáticos con compromiso autonómico, como ocurre en la polineuropatía diabética.

EL efecto neuroprotector del EGF puede entenderse, además, sobre la base de sus bien conocidas propiedades pleiotrópicas y neurorregenerativas (Yamada et al., 1997; Xian y Zhou, 2004). Este efecto no parece estar relacionado con una acción sobre el metabolismo de la ACR, un aspecto difícil de elucidar dado que el principal metabolito de esta sustancia química, la glicidamida, tiene las mismas propiedades neurotóxicas que la molécula original (Abou-Donia et al. Al., 1993). Los experimentos preliminares demuestran que el EGF no afecta las dosis letales (LD16, LD50 y LD84) de ACR en experimentos agudos de dosis-respuesta, o la tasa de mortalidad en la administración ACR subaguda (10 días) (datos no mostrados). Además, la susceptibilidad diferencial entre ondas F y el PS con respecto a la protección del EGF parece ser evidencia, aunque indirecta, de que dicha protección no es consecuencia de cambios en el metabolismo del ACR, porque si así fuera, cabría esperar que ambos parámetros se vean afectados en la misma proporción cuando se comparan con los controles.



En general, los resultados confirman que el sistema nervioso central, periférico y autónomo está involucrado en la neurotoxicidad inducida por ACR, y sugieren que la evaluación del efecto neuroprotector por medio de la electrofisiología en este modelo experimental podría ser relevante en términos de su traducción a la arena clínica. Por otra parte, estos resultados confirman la importancia del patrón de la onda F como un parámetro electrofisiológico sensible y muy característico de trastornos neuropáticos complejos el cual deberá considerarse al extrapolar estos resultados en futuros ensayos clínicos.

Resumen de Resultados

  1. Los resultados muestran que el EGF tiene un efecto neuroprotector en el contexto experimental de este estudio, en la neuropatía que aparece en ratas con diabetes inducida por estreptozotocina y en la neuropatía inducida por acrilamida en ratones y ratas.

  2. En el estudio realizado en ratas con diabetes inducida por estreptozotocina, el EGF normalizó la sensibilidad al estímulo nociceptivo y la velocidad de conducción nerviosa.

  3. En la neuropatía por acrilamida en ratones:

  • la administración concomitante con EGF protegió contra el deterioro del potencial de acción muscular compuesto (potencial M), lo que se expresó a través del valor de la amplitud pico a pico del potencial M y de la reducción progresiva de dicha amplitud a lo largo del período de inducción.

  • De igual forma, mejoró los síntomas clínicos.

  • En el análisis de regresión de la reducción progresiva de la amplitud del potencial M se puso en evidencia una relación dosis-efecto, donde la dosis de 5 mg/kg resultó ser muy efectiva, en comparación con la dosis de 1 mg/kg. Esta relación dosis-efecto demuestra que la neuroprotección observada es un efecto farmacológico real del EGF.

  1. En la neuropatía inducida por acrilamida en ratas:

  • La administración concomitante de EGF mejoró el deterioro de la onda F y del potencial sensorial expresado a través de sus índices integrados basados en el algoritmo compuesto por la latencia de inicio, la amplitud del potencial y su duración. Esta protección fue estadísticamente más notable en el caso del potencial sensorial, lo que demuestra la particular sensibilidad de la onda F en este tipo de neuropatía compleja, lo que debe tenerse en cuenta para estudios futuros en el contexto clínico.

  • Es de particular interés la demostración de que la inducción de la respuesta eréctil por apomorfina, notablemente afectada en las ratas intoxicadas con acrilamida, mejoró estadísticamente en el grupo que recibió concomitantemente el tratamiento con EGF, lo que sitúa al EGF como un candidato en la terapéutica de la función eréctil en pacientes con neuropatías de diverso origen.

Por el momento, estos resultados son coincidentes con estudios previos realizados en diferentes paradigmas experimentales (Xian y Zhou, 2004; García del Barco et al., 2011), y también respaldan observaciones previas realizadas por los angiólogos en la clínica que indicaban un posible efecto beneficioso del EGF en pacientes con neuropatía diabética (Acosta et al., 2006; Fernández-Montequín et al., 2007; Fernández-Montequín et al., 2009).

Estos resultados de conjunto demuestran por primera vez que el EGF puede ser útil en el tratamiento de neuropatías de diverso tipo.



Conclusiones

Para la conducción del presente trabajo se generó un modelo experimental de neuropatía periférica basado en la inyección crónica con acrilamida. Este modelo experimental de neuropatía periférica remeda los síntomas y signos más característicos de la neuropatía periférica asociada a la diabetes mellitus. Es decir, este biomodelo exhibe características clínicas y patrones electrofisiológicos que reflejan el compromiso de las esferas motora, sensitiva, y de la onda F, y alteraciones del sistema nervioso autónomo, evidenciado por el deterioro en el reflejo de erección. Todas estas evidencias sustentan la relevancia del modelo experimental con respecto a la enfermedad en cuestión, y por tanto, los resultados obtenidos, en términos del efecto regenerador del EGF en la neuropatía periférica, tienen una connotación importante en términos de pruebas de concepto robustas como evidencias preclínicas.

Los resultados del presente trabajo permiten sustentar de manera racional que, la carencia de factores tróficos como elemento fisiopatológico de la neuropatía periférica asociada a la diabetes mellitus, puede corregirse mediante el abordaje terapéutico con uno de los factores de crecimiento más pleiotrópicos y citoprotectores conocidos hasta la fecha, el EGF.

6. Acreditación del resultado mediante avales

Los resultados presentados en opción a este premio están avalados por una publicación en la revista especializada “Journal of Peripheral Nervous System” (2.3 FI), bajo el título: Neuroprotective effect of epidermal growth factor in experimental acrylamide neuropathy: an electrophysiological approach”. Dicho artículo fue escogido como artículo de portada del número 22 del 2017. Adicionalmente, estos resultados sustentan la patente “Método para la restauración neurofuncional de nervios periféricos en la neuropatía diabética” que se ha concedido en Australia, Canadá, Chile, China, Europa, Japón, Corea del Sur, México, Rusia, Sudáfrica, y Estados Unidos.



Publicaciones derivados de este trabajo

1. Perez-Saad H, Subiros N, Berlanga J, Aldana L, Garcia del Barco D. Neuroprotective effect of epidermal growth factor in experimental acrylamide neuropathy: an electrophysiological approach. J Peripher Nerv Syst 2017 Apr 1, 22, 106-111.



Patente

Método para la restauración neurofuncional de nervios periféricos en la neuropatía diabética

Concedida en Australia, Canadá, Chile, China, Europa, Japón, Corea del Sur, México, Rusia, Sudáfrica, y Estados Unidos.

7. Acreditación de la introducción del resultado

Con los resultados de este proyecto se prevé la solicitud de un estudio clínico fase I/II al CECMED. Adicionalmente, existe una contraparte académica, el Dr. Tood Levine Profesor de Neurología del Banner Good Samaritan Medical Center, Texas, EE.UU. El Dr. Levine es líder de opinión en el tema de neuropatía periférica solicitó el establecimiento de una colaboración con nuestro proyecto, para evaluar el efecto del EGF en la reinervación por fibras nerviosas finas.



Referencias

Abou-Donia MB, Ibraim SN, Corcoran JJ, Lack L, Friedman MA, Lapadula DM (1993). Neurotoxicity of glycilamide, an acrylamide metabolite, following intraperitoneal injections in rats. J. Toxicol. and Environm. Health. 39: 447-464.


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