Centro de ingeniería genética y biotecnologíA "Efecto regenerador del Factor de Crecimiento Epidérmico en la neuropatía periférica" Trabajo presentado como propuesta a



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CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
"Efecto regenerador del Factor de Crecimiento Epidérmico en la neuropatía periférica"

Trabajo presentado como propuesta a

Premio Nacional de la Academia de Ciencias de Cuba

2017


Tipo de aporte: Científico-técnico y social
Rama: Ciencias Biomédicas

Autores principales: Héctor Pérez-Saad, Diana Garcia del Barco Herrera, Nelvys Subirós Martínez, Jorge Berlanga Acosta, Gerardo Guillén Nieto, Yaima Rodríguez Virulich, Sasha Sánchez Alvarez, Lizet Aldana Velázquez



1. Título del resultado: “Efecto regenerador del Factor de Crecimiento Epidérmico en la neuropatía periférica"
Entidad Ejecutora Principal: Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología
Autores principales: Héctor Pérez-Saad, Diana Garcia del Barco Herrera, Nelvys Subirós Martinez, Jorge Berlanga Acosta, Gerardo Guillén Nieto, Yaima Rodríguez Virulich, Sasha Sánchez Alvarez, Lizet Aldana Velázquez.
Otros autores: José Esteban Sauri, Verena Lucila Muzio Gonzalez, Joel Gutierrez Gil, Rosa María Coro-Antich, Sandra Rodriguez Salgueiro, José Suárez Alba y Sonia González Blanco.
Número de colaboradores: 3
Filiación: Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB), La Habana.
Resumen
La neuropatía periférica (NP) es una complicación frecuente de la diabetes mellitus, enfermedad que afecta a más de 380 millones de personas en todo el mundo, de los cuales el 30 % la padece. La NP se asocia a sintomatología dolorosa, trastornos cardiovasculares, digestivos, disfunción sexual, y pérdida de la fuerza y tono muscular. La fisiopatología de la neuropatía periférica en el diabético, además de los cambios metabólicos, vasculares e inmunológicos, incluye un déficit de factores tróficos. Para el tratamiento de la NP en el diabético solo se usan los analgésicos y las terapias dirigidas al control metabólico. Sin embargo, el déficit trófico no se incluye como blanco en ninguna de las aproximaciones terapéuticas vigentes. El objetivo del presente trabajo fue demostrar que el efecto neuroprotector del factor de crecimiento epidérmico (EGF), administrado como soporte trófico, podía contribuir a mejorar los signos de NP asociada a la diabetes mellitus. Para dicha demostración se usaron modelos experimentales de NP, diabética e inducida con acrilamida, y se evaluaron los signos clínicos y los parámetros electrofisiológico más relevantes y patognomónicos en la NP del diabético.

Se evidenció un efecto neuroprotector del EGF en términos de recuperación de la sensibilidad al calor, del potencial de acción muscular complejo, de los potenciales sensitivos, de la onda F, de la respuesta de erección peniana inducida por apomorfina, y de la morbilidad general, todo lo cual sugiere que el efecto neuroprotector del EGF se dirige hacia el componente motor, sensorial y autonómico de la NP. Estos resultados devienen en prueba de concepto robusta a favor del uso del EGF en el tratamiento de la NP de la diabetes mellitus y otras NP de diversas etiologías.



Estos resultados se publicaron en “Journal of Peripheral Nervous System” (2.3 FI), bajo el título: Neuroprotective effect of epidermal growth factor in experimental acrylamide neuropathy: an electrophysiological approach”, y fue escogido como artículo de portada del número 22 del 2017. Adicionalmente, estos resultados sustentan la patente “Método para la restauración neurofuncional de nervios periféricos en la neuropatía diabética” que se ha concedido en Australia, Canadá, Chile, China, Europa, Japón, Corea del Sur, México, Rusia, Sudáfrica, y Estados Unidos.
2. Aporte científico personal de cada autor

Autores principales:


  • Héctor Pérez-Saad (15%): Participó en el diseño y en la ejecución de todos los experimentos del modelo de neuropatía inducida con acrilamida y demostró la relevancia de este modelo respecto a la neuropatía diabética. Diseñó y realizó el experimento de inducción de erección mediada por apomorfina

Diana Garcia del Barco Herrera (15%): Concepción general del diseño experimental, ejecución de los experimentos, diseño de la escala para evaluar el grado neurológico. Procesamiento estadístico, confección del manuscrito publicado y coautora de la patente.

Nelvys Subirós Martinez (5%): participó en la evaluación clínica y electrofisiológica de todos los experimentos del modelo de neuropatía periférica inducido con acrilamida. Realizó toda la documentación de los experimentos adherida a las regulaciones de buenas prácticas de laboratorio.

  • Jorge Berlanga Acosta (5%): participó en el diseño de los experimento de diabetes inducida con estreptozotocina, y en la selección de las dosificaciones del EGF empleadas en dichas evaluaciones. Es autor de la patente y participó en la discusión del manuscrito.

  • Gerardo E. Guillén Nieto (5%): participó en los debates científicos y en el diseño de los experimentos en los modelos de diabetes inducida con estreptozotocina y de neuropatía inducida con acrilamida. Es coautor de la patente.

  • Yaima Rodriguez Virulich (3%) apoyó la realización de los experimentos y estuvo a cargo del mantenimiento de los animales de experimentación bajo los procedimientos de anestesia.

  • Sasha Sánchez Alvarez (3%): apoyó la realización de los experimentos y trabajó en el mantenimiento de los animales en condiciones del laboratorio, su cuidado y alimentación..

  • Lizet Aldana Velázquez (6%): asesoró la realización de los experimentos en el marco de las buenas prácticas en el cuidado de los animales de experimentación. Es coautora del manuscrito publicado..

Otros autores:

  • José Esteban Saurí Chavez (5%): Contraparte clínica de este proyecto, trabajó en la extrapolación de los resultados preclínicos a la investigación clínica.

  • Verena Lucila Muzio González (5%): Directora de la División de Estudios Clínicos, trabajó en la extrapolación de los resultados preclínicos a la investigación clínica.

  • Joel Gutierrez Gil (5%): Es la contraparte clínica de este proyecto y como tal participó en todas las discusiones y debates científicos en torno a los diseños experimentales para la fase preclínica. Realizó la revisión crítica del manuscrito previo a su publicación.

  • Rosa María Coro-Antich (3%): Revisión crítica del manuscrito publicado.

  • José Suárez Alba (3%): Procesamiento de los nervios para los análisis de anatomía patológica.

  • Sandra Rodríguez Salgueiro (3%): Procesamiento de las láminas de los nervios y tinción especial para el contraste de la mielina.

  • Sonia González Blanco (1%): Especialista en patentes, realizó el asesoramiento y tramitación de la patente “Método para la restauración neurofuncional de nervios periféricos en la neuropatía diabética”

Colaboradores: Maria de los Ángeles Fernández, Isela Garcia Tamayo, Maydee Nuñez Yaugel
3. Autor para la correspondencia:
Dr.C Diana Garcia del Barco Herrera

Proyecto de Neuroprotección Departamento de Farmacéuticos.

Investigaciones Biomédicas. CIGB.

Ave 31 e/ 158 y 190, Cubanacán, Playa, La Habana 10600, POB 6162.

Teléfono: 72504397; Fax: 271 4764.

E-mail: diana.garcia@cigb.edu.cu



4. Comunicación corta de descripción del resultado

Introducción

En la búsqueda de agentes terapéuticos para tratar neuropatías, hemos identificado el factor de crecimiento epidérmico (EGF) como un fármaco prometedor. Después de su descubrimiento en las glándulas salivales de ratón, EGF fue reconocido como un miembro de una familia de péptidos cuyos receptores son receptores transmembrana de tirosina-quinasa (Carpenter 2000, Higashiyama et al., 2008). Durante más de cuatro décadas, el papel fisiológico y las propiedades farmacológicas del EGF y sus receptores se han documentado ampliamente referido a su acción mitogénica, como promotor de la Neurogénesis, por tener un papel importante en la ontogenia y en la respuesta a lesiones del sistema nervioso.


Estos antecedentes denotan el papel fisiológico de EGF o sus análogos y sus receptores en la neuroprotección. También algunos miembros de la familia EGF y EGFR se encuentran aumentados en lesiones experimentales del nervio ciático (Xian y Zhou, 1999). Teniendo en cuenta estos antecedentes, parece razonable inferir que las propiedades farmacológicas del EGF lo convierten en un buen candidato para probarse como neuroprotector en modelos de neuropatía periférica.
El trabajo presentado se basa en las evidencias de dos bloques experimentales, el primero enfocado a la demostración del efecto del EGF en el modelo experimental de neuropatía diabética inducida por estreoptozotocina en ratas, y el segundo en la neuropatía inducida con acrilamida.
Resultados
1er Bloque experimental
La estreptozotocina induce un daño en el parénquima endocrino del páncreas, se reduce la secreción de insulina y los animales se tornan diabéticos. Esto se evidencia por un aumento de la glicemia, una pérdida de la sensibilidad al calor y una reducción de la velocidad de conducción del impulso nervioso (Figura 1).

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Figura 1. Esquema representativo del protocolo de inducción de diabetes mediante estreptozotocina, y de los principales signos que remedan la neuropatía diabética (hiperglicemia, reducción de la sensibilidad y de la velocidad de la conducción nerviosa. La figura representa, además, el esquema de tratamiento con EGF y los controles de vehículo o placebo.


En los ratones con diabetes inducida por estreptozotocina la neuropatía periférica se expresó en una respuesta más rápida al estímulo doloroso ocasionado por la introducción de la cola en el agua a 55°C, por un incremento en la latencia del potencial sensorial y por una reducción en la amplitud del potencial de acción muscular compuesto. Estos parámetros fueron menos afectados en los animales que recibieron EGF (Figura 2).
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Figura 2. A los 22 días de tratamiento con EGF se evidenció que se restaura la velocidad de conducción nerviosa y la sensibilidad al calor.


2do Bloque experimental
Evaluación del efecto del EGF en el biomodelo de neuropatía periférica inducida con Acrilamida
La acrilamida induce la formación de aductos entre las proteínas que participan en el transporte axonal, y este fenómeno se manifiesta desde el punto de vista clínico y electrofisiológica de manera muy similar a lo que ocurre en la neuropatía diabética.

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Figura 3. Esquema representativo del protocolo experimental donde los animales se trataron con acrilamida durante 8 semanas y al final de este periodo se conformaron 3 grupos de tratamiento; EGF 1mg/kg, EGF 5 mg/kg y vehículo.


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El tratamiento con acrilamida produjo síntomas claros de neuropatía, con un aumento significativo en el puntaje neurológico en comparación con un control saludable.


El efecto del tratamiento con EGF, independientemente de la dosis, produjo una reducción de la sintomatología neurológica (Figura 4).
Sin embargo, desde el punto de vista electrofisiológico solamente la dosis de 5 mg/kg produjo una restauración en el potencial de acción muscular compuesto, en la onda F y en el potencial sensitivo.

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Figura 5. Análisis de regresión lineal de la reducción acumulativa de la amplitud del potencial de acción muscular compuesto muestra que los grupos tratados con vehículo y EGF-1mg/kg no difieren significativamente entre sí, pero ambos difieren significativamente del control sano y del grupo tratado con EGF-5mg/kg, cuyas líneas de regresión correspondientes están superpuestas.

El análisis conjunto de las ondas F y del potencial de acción sensitivo involucra funciones de las estructuras centrales de la médula espinal así como de las fibras sensitivas y motoras de los nervios periféricos. En particular, las ondas F se consideran un parámetro electrofisiológico útil en la investigación de diferentes enfermedades neuropáticas, siendo especialmente relevantes en los trastornos que involucran componentes centrales y periféricos, como diabetes mellitus y algunas radiculopatías.
Las ondas F y el potencial de acción sensitivo aparecen regularmente en ratas del control saludable, la acrilamida produjo una reducción marcada y significativa de estos parámetros.
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Figura 6. El potencial sensitivo y la onda F comprometidos en el modelo de neuropatía inducida por acrilamida, se recuperan con el tratamiento de EGF.


Aunque el hipotálamo es el sitio de acción primario de la apomorfina como inductor de la erección del pene, una acción mediada a través de receptores de dopamina D2, la complexión de este reflejo necesita la integridad del plexo de nervios pélvicos. Este plexo, al igual que otras terminaciones nerviosas resulta afectada en la neuropatía inducida por la acrilamida al igual que ocurre en la neuropatía diabética.

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Figura 7.La inducción de neuropatía con acrilamida se acompaña de un deterioro del reflejo de erección inducido por apomorfina. El tratamiento con EGF (5mg/kg) en los animales que recibieron acrilamida mejora el reflejo de erección inducido por apomorfina.


Estos resultados sugieren que el EGF podría ser útil para el tratamiento de la disfunción eréctil presente en otros trastornos neuropáticos con compromiso autonómico, como la polineuropatía diabética.
En conjunto, estos resultados confirman que el sistema nervioso central, periférico y autónomo está involucrado en la neuropatía inducida por acrilamida, y sugieren que la evaluación del efecto neuroprotector por medio de la electrofisiología en este modelo experimental es relevante en términos de su traducción a la arena clínica. Además, estos resultados confirman la importancia de las ondas F como un parámetro electrofisiológico sensible especial en trastornos neuropáticos complejos

El modelo de neuropatía inducida con acrilamida exhibe un compromiso del componente motor, sensitivo y autonómico que remedan las afectaciones que ocurren en la neuropatía diabética en el humano.

El efecto del EGF en la reducción de estos componentes constituye una prueba de concepto robusta, y sustenta el uso del EGF como alternativa terapéutica curativa para la NP asociada a la Diabetes mellitus.

Referencias


  • Carpenter G (2000). The EGF receptor: a nexus for trafficking and signaling. Bioessays 22: 697-707

  • Higashiyama S, Iwabuki H, Morimoto C, Hieda M, Inoue H, Matsushita N (2008). Membrane-anchored growth factors, the epidermal growth factor family: beyond receptor ligands. Cancer Sci. 99:214-220.

  • Xian CJ, Zhou X-F (1999). Roles of transforming growth factor-α and related molecules in the nervous system. Molecular Neurobiol. 20:157-183.

5. Descripción detallada del resultado

INTRODUCCIÓN

La diabetes afecta más de 380 millones de personas en el mundo, de los cuales el 30 % sufre de neuropatía diabética (Fig. 1).

El daño fisiopatológico más importante en la diabetes es la microangiopatía, que afecta prácticamente a todos los órganos y sistemas en el organismo, lo que incluye a los nervios periféricos, con afectaciones de fibras sensoriales y motoras, así como las fibras que conducen la información del sistema nervioso autónomo. Por lo tanto la neuropatía diabética afecta los movimientos, la sensibilidad a diversos estímulos físicos y las funciones de diversos órganos del sistema nervioso autónomo. (Fig. 2 y 3)

Figura 1


EPIDEMIOLOGÍA

Tomado de WHO: http://www.euro.who.int/en/health-topics/noncommunicable-diseases/diabetes/data-and-statistics

EL 30 % DE LOS DIABÉTICOS PADECE DE NEUROPATÍA

Figura 2


Endocrinol Nutr. 2007;54(6):307-14

Neuropatía diabética



Desórdenes asociados a la pérdida de sensasión

Los nervios sensitivos son dañados



Desórdenes por afectación de los nervios motores

Los nervios que llevan impulso a los músculos



Neuropatía autonómica

Músculos como el corazón, el intestino y la vejiga

no los controlamos volutariamente, funcionan

automáticamente

Figura 3


APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS VIGENTES EN LA NEUROPATÍA PERIFÉRICA

Fisiopatología de la Neuropatía diabética

!!A pesar de que está reconocido un déficit trófico, no existe un tratamiento dirigido hacia ese blanco!!
Pregabalin

Duloxetine

tramadol/acetaminofen combination + gabapentin

Pentoxifilina

Antidepresivos como amitriptilina

Carbamazepina

En la búsqueda de agentes terapéuticos para tratar neuropatías, hemos identificado el factor de crecimiento epidérmico (EGF) como un fármaco prometedor. Después de su descubrimiento en las glándulas salivales de ratón, el EGF fue reconocido como un miembro de una familia de péptidos cuyos receptores son receptores transmembrana de tirosina-quinasa (Carpenter 2000, Higashiyama et al., 2008). Durante más de cuatro décadas, el papel fisiológico y las propiedades farmacológicas del EGF y sus receptores se han documentado ampliamente:


  • Potente acción mitogénica en fibroblastos humanos cultivados y la línea celular murina clonal 3t3;

  • Promotor de la neurogénesis (Doetsch et al., 2002 ; Knapp y Adams 2004; Du et al., 2009; Karimi-Abdolrezaee et al., 2012).

  • Los receptores de EGF (EGFR) están ampliamente distribuidos en los sistemas nerviosos central y periférico (Kinoshita et al., 1990; Planas et al., 1998; Simpson et al., 1982; Sun et al., 2005)

  • Los receptores del EGF se sobre-expresan en células de Schwann y fibroblastos en respuesta a la lesión nerviosa (Toma et al., 1992).

Estos antecedentes denotan el papel fisiológico de EGF o sus análogos y sus receptores en la neuroprotección. También, algunos miembros de la familia EGF y EGFR se encuentran aumentados en lesiones experimentales del nervio ciático (Xian y Zhou, 1999).

Teniendo en cuenta estos antecedentes, parece razonable inferir que las propiedades farmacológicas del EGF lo convierten en un buen candidato para ser evaluado como neuroprotector en modelos de neuropatía periférica. En esta dirección, los objetivos de este trabajo fueron estudiar el efecto del EGF en el modelo de neuropatía diabética inducida por estreptozotocina, y en el modelo de neuropatía inducida por acrilamida (ACR), que comparten entre sí características sintomáticas y electrofisiológica, similares a otras polineuropatías -(Watanabe et al., 1994; Acevedo et al., 2000; Tareke et al., 2002; Sickles et al., 2007; Fennell et al., 2015).

MATERIALES Y MÉTODOS

Los ratones C57BL / 6 y las ratas Wistar obtenidos en el Centro Nacional para animales de laboratorio (CENPALAB) se adaptaron a condiciones ambientales del laboratorio antes de comenzar los experimentos: 12/12 ciclo de luz-oscuridad; 65% de humedad relativa; temperatura ambiente de 22 ± 1 ° C. Se alojaron 10 ratones o 3 ratas por jaula (jaulas de policarbonato T2 de TECNIPLAS, Italia), con libre acceso a agua y alimentos. Los experimentos se aprobaron por el comité institucional de investigación animal de acuerdo con las normas internacionales e institucionales vigentes.

Fármacos: la ACR se adquirió de Sigma-Aldrich Chemical; el EGF (factor de crecimiento epidérmico humano recombinante -EGF1-52- expresado en Saccharomyces cerevisiae se adquirió de Heber-Biotec, ketamina (LIORAD); diazepam (IMEFA); y apomorfina (Sigma-Aldrich Chemical). Todas las administraciones de fármacos se realizaron por vía intraperitoneal, en volúmenes de 0.01 ml por gramo de peso corporal.

La electrofisiología se llevó a cabo con un aparato Neuronic-5 (Neuronic S.A.). Los electrodos para la estimulación nerviosa y el registro de potenciales bioeléctricos se prepararon a partir de agujas hipodérmicas (27 G).



Efecto del EGF en la neuropatía diabética inducida por estreoptozotocina en ratas.

Se emplearon 3 grupos de 20 ratas machos Wistar de 300 a 400 g de peso corporal. Dos grupos recibieron una dosis de 60 mg/kg de estreptozotocina por vía intraperitoneal. Otro grupo recibió buffer-citrato como vehículo, el cual se administró en el mismo volumen, también por vía intraperitoneal. A partir de estos tratamientos, uno de los grupos recibió una dosis de 150 mg diarios de EGF por vía intraperitoneal durante 28 días, y los otros dos grupos recibieron sólo PBS.

A partir de la primera semana después de la inyección de estreptozotocina se determinó la glicemia en todos los animales con el auxilio de un glucómetro convencional (SUMA) y se comprobó que los animales inyectados con estreptozotocina mantenían niveles altos de glicemia a lo largo de todo período experimental. (Fig. 4)

Fig. 4. Niveles de glicemia en ratas tratadas con estreptozotocina.

Para evaluar el efecto de la hiperglicemia inducida por estreptozotocina, los animales se sometieron a una prueba sensibilidad al dolor, mediante la técnica de inmersión de la cola en agua a 55oC. (Hough et al. 2004), y se midió el tiempo de reacción consistente en el levantamiento de la cola.

De igual forma, se registraron los potenciales sensitivos en la cola, para lo cual se colocaron electrodos de estimulación en la base de la cola y electrodos de registro a un centímetro del extremo distal. Los parámetros de estimulación fueron: 15 mA de intensidad, 0.1 Hz de frecuencia y 0,1 ms de duración. La latencia de inicio del potencial se tomó como medida para el cálculo de la velocidad de conducción en metros/segundo.



Efecto del EGF en la neuropatía inducida por acrilamida en ratones

Se usaron ratones machos con 20 a 24 g de peso corporal. Se dividieron en 4 grupos de 20 animales cada uno: 1) Control saludable, tratado solo con solución salina tamponada con fosfato (PBS); 2) ACR+vehículo, tratado con ACR y PBS (vehículo); 3) ACR+EGF-1, tratado con ACR y 1 mg/kg de EGF; y 4) ACR+EGF-5, tratado con ACR y 5 mg/kg de EGF. Los tratamientos se realizaron 5 días a la semana durante 6 semanas. Las dosis ACR fueron 30 mg/kg durante 4 semanas y 40 mg/kg la quinta y sexta semanas. Las dosis de EGF y el volumen de PBS se dividieron en dos inyecciones por día (a las 9:00 y 15:00 h), y la ACR se administró solo una vez, por la mañana.

Electrofisiología: los animales se anestesiaron con ketamina (100 mg/kg) y diazepam (5 mg/kg). Los potenciales musculares (M) se registraron en el músculo gastrocnemio durante la estimulación eléctrica del nervio ciático, como se informó previamente (Acevedo et al., 2000; Brites et al., 2009). Los electrodos de estimulación (SE) se introdujeron en la región anatómica que rodea el nervio ciático, y los electrodos de registro (RE) se insertaron en el músculo gastrocnemio (electrodo activo) y en la membrana interdigital de la misma extremidad. La estimulación eléctrica consistió en un pulso cuadrado con 15 mA, 0.1 ms de duración y 0.1 Hz de frecuencia. Las evaluaciones electrofisiológicas se realizaron con intervalos de 15 días, de la siguiente manera: antes de cualquier tratamiento (T0) y en los días 15 (T1), 30 (T2) y 45 (T3) de tratamiento.

Para el análisis estadístico se realizó una prueba de regresión lineal para comparar la reducción acumulada de la amplitud (pico a pico) del potencial M, de la siguiente manera: (T0-T1) + (T1-T2) + (T2-T3). Para este propósito, la reducción acumulada en la amplitud del potencial M se calculó primero para cada animal en particular. Además, se calculó la media y la desviación estándar (DE) de la amplitud de M de todos los grupos, antes de cualquier tratamiento (T0).

Los animales de cada grupos cuyas amplitudes de M estaban por debajo de dicha media en más de dos SD se consideraron como enfermos, de acuerdo con un criterio estadístico establecido (Guilloux et al., 2011). Las proporciones de animales enfermos en cada grupo tratado con ACR se compararon con los controles saludables mediante la prueba de la Probabilidad Exacta de Fischer.

Evaluación clínica. Los animales se colocaron individualmente en un campo abierto (80 x 80 cm) y se observaron durante 2 minutos. Se construyó una escala para la evaluación neurológica (Tabla 1), que permitía la asignación de valores numéricos a diferentes signos físico-motores, que incluye el reflejo de extensión al ser suspendidos por la cola (Huang et al., 2009).

TABLA 1. PARÁMETROS CLÍNICOS PARA LA EVALUACIÓN NEUROLÓGICA

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Prueba de fuerza de agarre: se utilizó la resistencia de agarre como el índice de fuerza muscular (Crobbe et al., 2003). Los ratones se colocaron individualmente durante 20 segundos en una rejilla de alambre horizontal con orificios de 5 mm2, que luego se volteó hacia abajo para medir el tiempo de suspensión, durante un máximo de 3 minutos.




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